隨著城市化的發(fā)展，來自交通、工業(yè)、資源開采、建筑和娛樂活動(dòng)的噪音污染在時(shí)間和空間上不斷擴(kuò)大，陸地和水中的人為噪聲增加，對人類和野生動(dòng)物的健康造成了越來越多的不良影響。有研究表明，長期暴露于人為噪聲會(huì)對魚類物種造成包括生存能力下降、生長受損、生理壓力等方面的的負(fù)面影響。基于目前快速變化的水下聲音景觀，研究不同的噪聲狀況如何影響魚類的發(fā)育、生理和行為至關(guān)重要。本文測試了暴露于不斷增加的和不同時(shí)間模式下的噪音對斑馬魚幼魚發(fā)育、生理壓力和行為模式的影響，以探究噪音如何影響動(dòng)物的個(gè)體發(fā)育情況。
實(shí)驗(yàn)方法
本研究通過測量暴露于不同噪聲水平和時(shí)間模式變化的實(shí)驗(yàn)組之間，斑馬魚孵化率、總長度、死亡率、心率、皮質(zhì)醇水平等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，來研究噪聲對斑馬魚幼魚的發(fā)育、生理壓力和行為模式的影響。
實(shí)驗(yàn)對象
在斑馬魚受精后2小時(shí)，從2至6個(gè)繁殖箱（每個(gè)箱包含約10只雌性和5只雄性）收集魚卵。將收集的卵混合在含有胚胎培養(yǎng)基的單個(gè)培養(yǎng)皿中，并分配到不同組，每組50個(gè)樣本，共分為3-5組，每組被分配到不同的聲學(xué)實(shí)驗(yàn)箱。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
為了測試振幅對斑馬魚幼魚的影響，研究使用兩個(gè)不同振幅或聲壓級（SPL）的連續(xù)白噪聲（CN）聲音文件，即130 dB（CN130）和150 dB（CN150），這些噪聲水平與淡水水生環(huán)境中的人為噪聲相似，用來模擬人為水中噪音。
為了評估不同噪聲時(shí)間機(jī)制的影響，生成了三個(gè)額外的間歇噪聲和60分鐘持續(xù)噪聲（圖1）。三個(gè)額外的間歇噪聲為：IN1-持續(xù)時(shí)間為5-12 s的短噪聲段，間隔為1-120 s的無聲間隔（每小時(shí)60次噪聲事件），達(dá)到約15%的總噪聲暴露；IN2-30-60秒的中等噪聲段，間隔1-10分鐘的靜默，每小時(shí)15個(gè)噪聲段，總體噪聲暴露與IN1相似；和IN3-15分鐘的長噪聲段，間隔15分鐘的靜默期（約占總噪聲的50%）。測試所用聲音通過軟件將聲音調(diào)整為相對平坦的頻譜，放置于聲學(xué)實(shí)驗(yàn)箱中的水下?lián)P聲器進(jìn)行播放。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集
上午10點(diǎn)至11點(diǎn)，檢查受精后48小時(shí)胚胎存活率。兩個(gè)發(fā)育階段，即受精后3天和受精后5 天，在每天早晨固定時(shí)間收集斑馬魚形態(tài)學(xué)和生理學(xué)數(shù)據(jù)。
圖1
斑馬魚測量指標(biāo)
（1）形態(tài)學(xué)和心率測量。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，評估聲學(xué)處理對斑馬魚幼體形態(tài)發(fā)育和心率的影響。本研究使用Noldus 斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)對斑馬魚進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析及自動(dòng)檢測心臟活動(dòng)。
斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)（DanioScope）是用于評估和分析斑馬魚胚胎及幼魚活動(dòng)的專業(yè)軟件。該系統(tǒng)可以通過視頻文件和靜態(tài)圖像測量斑馬魚胚胎及幼魚胎動(dòng)、心跳、血液（和腸道）流動(dòng)、形態(tài)學(xué)特征等多種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。并且，系統(tǒng)支持高通量的斑馬魚測試，可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、獲取數(shù)據(jù)和分析結(jié)果的大量時(shí)間，提升研究效率。
（2）卵黃囊&皮質(zhì)醇測量。分析基于兩個(gè)不同發(fā)育階段的斑馬魚幼魚，以測試噪聲水平增加和不同噪聲時(shí)間模式對卵黃囊和皮質(zhì)醇生理指標(biāo)的影響。
（3）光/暗選擇測量。用于評估斑馬魚幼體的環(huán)境壓力，通過在光亮側(cè)花費(fèi)的時(shí)間百分比的增加反映了該模型生物體的焦慮情況。
（4）行為模式。本研究會(huì)對斑馬魚幼體進(jìn)行自發(fā)交替行為（SAB）測試，該行為指動(dòng)物在環(huán)境下連續(xù)轉(zhuǎn)彎過程中交替轉(zhuǎn)彎方向的趨勢，用來探究噪音對斑馬魚行為模式的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
孵化、生長和死亡率
本研究中使用的噪聲對斑馬魚胚胎的孵化率沒有顯著影響，也沒有引起明顯的胚胎發(fā)育異常。此外，噪聲水平和時(shí)間模式的變化不會(huì)影響測得的斑馬魚的總長度。但是，在連續(xù)噪聲（CN）下，觀察到CN150噪聲暴露導(dǎo)致斑馬魚死亡率顯著增加（圖2，C）。噪聲時(shí)間的變化也導(dǎo)致所有噪聲暴露組的死亡率增加（圖2，D）。間歇性的短噪音（IN1）和中噪音（IN2）周期導(dǎo)致較高死亡率，而呈現(xiàn)長噪音段（IN3）的治療與對照組相比未導(dǎo)致顯著死亡率（圖2，D）。
圖2
生理應(yīng)激指標(biāo)。心率、卵黃囊消耗和皮質(zhì)醇水平隨著噪聲水平的增加而顯著增加，這清楚地表明斑馬魚較高的生理應(yīng)激。對照組幼魚在受精后3天時(shí)的心率約為173±30 bpm，在播放CN150后增加到191±60 bpm。而在受精后5天時(shí)，心率約為203±40（對照組），在CN150處理后增加到224±50 bpm。在受精后3天和5天幼魚中，隨著噪聲水平的增加，證實(shí)了心率的顯著的增加，與對照相比，CN150引起的差異最大（圖3，A）。
同樣，在受精后3天和5天幼魚中，與對照組相比，隨著噪聲水平的增加，卵黃囊消耗量顯著增加（圖3，B）。噪音干擾時(shí)間的變化對心率和卵黃囊消耗產(chǎn)生影響，表明噪聲時(shí)間機(jī)制對于調(diào)節(jié)生理應(yīng)激和胚胎內(nèi)源性能量儲備的消耗非常重要。
在受精后3天和受精后5天，心率受噪聲時(shí)間變化的顯著影響，與受精后5天的間歇性噪音相比，連續(xù)噪聲造成的影響最大（圖3，C）。此外，這些噪聲處理之間的卵黃囊消耗量存在顯著差異（圖3，D）?？傮w而言，心率與卵黃囊大小呈負(fù)相關(guān)，這意味著心率較高的個(gè)體消耗能量儲備更快（圖3，E）。
通過皮質(zhì)醇測量證實(shí)了噪聲誘導(dǎo)的生理應(yīng)激，皮質(zhì)醇水平隨著噪聲振幅的增加而顯著升高（圖4），噪聲時(shí)間機(jī)制的變化導(dǎo)致皮質(zhì)醇的變化。
圖3
圖4
行為模式。為了評估行為水平的潛在變化，使用焦慮相關(guān)的光/暗選擇測試（圖5，A），進(jìn)一步測試了暴露于150dB連續(xù)噪聲（CN150）受精后5天的幼魚。根據(jù)測量，暴露于噪音的樣本表現(xiàn)出較強(qiáng)的避暗或暗視癥（圖5，B）。同時(shí)，使用自發(fā)交替行為（SAB）實(shí)驗(yàn)（圖6，A）測試了斑馬魚幼魚的探索行為。結(jié)果顯示，在無聲控制條件下飼養(yǎng)的70%的幼魚表現(xiàn)出正常的游泳交替，而噪聲處理組（CN150）僅為34%（圖6，B）。在曠場中進(jìn)一步研究了這些樣本的游泳模式，發(fā)現(xiàn)噪聲處理過的幼魚的覆蓋面積減少。
圖5
圖6
討論
本文測試了不斷增加的噪聲程度和不同的噪音時(shí)間機(jī)制對斑馬魚幼魚的影響。研究結(jié)果顯示：
1. 噪聲不影響一般斑馬魚胚胎的發(fā)育或孵化，但較高的噪聲水平會(huì)導(dǎo)致死亡率增加；
2. 在受精后3天和5天，斑馬魚心率、卵黃囊消耗量和皮質(zhì)醇水平隨著噪聲水平的增加而顯著增加；
3. 噪聲時(shí)間模式的變化表明，噪音持續(xù)的機(jī)制比噪聲暴露的總時(shí)間更重要；
4. 暴露于連續(xù)性高噪聲的斑馬魚幼魚在焦慮相關(guān)的明/暗選擇測試中表現(xiàn)出更高的暗回避能力，并且自發(fā)交替行為受損；
本文通過研究噪音對水生生態(tài)系統(tǒng)中斑馬魚幼魚的發(fā)育、生理壓力和行為模式等的影響，強(qiáng)調(diào)了對噪音管理的重要性。
參考文獻(xiàn)
Lara R A, Vasconcelos R O. Impact of noise on development, physiological stress and behavioural patterns in larval zebrafish. Scientific Reports, 2021, 11(1): 1-14.
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