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呼吸是維持所有動(dòng)物身體機(jī)能的重要組成部分。因此，當(dāng)氧氣穩(wěn)定狀態(tài)被破壞時(shí)，身體往往會(huì)通過(guò)調(diào)整呼吸參數(shù)來(lái)做出反應(yīng)。然而，在斑馬魚(yú)胚胎或幼魚(yú)等小型生物中，客觀地測(cè)量呼吸運(yùn)動(dòng)已被證明是困難的。
本文將探討海德堡大學(xué)的研究人員對(duì)我們的產(chǎn)品斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)的新穎應(yīng)用。Nadine K?mmer和她的同事使用斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)客觀地測(cè)量斑馬魚(yú)的呼吸運(yùn)動(dòng)，并將這種方法與手動(dòng)評(píng)估進(jìn)行了比較[1]。

為什么不手動(dòng)測(cè)量呼吸？
維持氧氣穩(wěn)態(tài)非常重要，因?yàn)檠鯕馐峭ㄟ^(guò)產(chǎn)生有氧能量以維持細(xì)胞代謝所必需的。當(dāng)暴露在低氧環(huán)境（缺氧）中時(shí)，魚(yú)類(lèi)往往會(huì)增加呼吸動(dòng)作，以增強(qiáng)氧氣提取。相反，當(dāng)暴露在高氧環(huán)境（高氧）中時(shí)，他們會(huì)通過(guò)減少呼吸來(lái)節(jié)省能量，這也可以防止過(guò)量的氧氣攝入，從而防止氧化應(yīng)激。然而，這種呼吸頻率降低的潛在負(fù)面影響是血液中二氧化碳的積聚，導(dǎo)致酸中毒。
由此我們可以得出，呼吸是魚(yú)類(lèi)對(duì)環(huán)境生理反應(yīng)的良好指標(biāo)。然而，手動(dòng)計(jì)算斑馬魚(yú)的呼吸既耗時(shí)，又不可靠。可靠性問(wèn)題在一定程度上使人工計(jì)數(shù)在現(xiàn)代科學(xué)時(shí)代變得不可行。


缺乏良好的客觀方法
雖然客觀的衡量標(biāo)準(zhǔn)確實(shí)存在，但對(duì)于大多數(shù)研究來(lái)說(shuō)，它們并不是最佳的。將電極連接到鰓蓋（為鰓提供結(jié)構(gòu)支撐和保護(hù)的骨骼）進(jìn)行了研究。然而，這種方法非常具有侵入性，只適用于較大的魚(yú)類(lèi)，而不適用于胚胎和幼魚(yú)。
電極也以非侵入性的方式被用于檢測(cè)由生物電信號(hào)介導(dǎo)的水電導(dǎo)率的變化。然而，由于魚(yú)胚胎的大小，它們的身體運(yùn)動(dòng)會(huì)干擾呼吸運(yùn)動(dòng)的檢測(cè)，因此不適合對(duì)魚(yú)胚胎進(jìn)行研究。

每一次呼吸，都會(huì)測(cè)量
Nadine K?mmer和她的同事著手解決這個(gè)問(wèn)題。為了比較斑馬魚(yú)不同生命階段的呼吸運(yùn)動(dòng)和反應(yīng)，對(duì)4天大的斑馬魚(yú)胚胎和12天大的幼魚(yú)進(jìn)行了測(cè)量。魚(yú)類(lèi)短期暴露于（1小時(shí)）水中不同濃度的lindane（引起呼吸壓力的神經(jīng)毒性農(nóng)藥）、溶劑對(duì)照組中。
視頻記錄是在魚(yú)胚胎被麻醉的同時(shí)進(jìn)行的，以防止身體運(yùn)動(dòng)干擾測(cè)量。將魚(yú)轉(zhuǎn)移到凝膠袋中后，對(duì)其進(jìn)行2分鐘的馴化，然后在顯微鏡下以每秒25幀的幀速率對(duì)魚(yú)進(jìn)行視頻跟蹤。
這些視頻隨后被用于手動(dòng)計(jì)數(shù)以及斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)中的分析。人工計(jì)數(shù)是由兩名觀察者通過(guò)觀察魚(yú)的嘴或蓋來(lái)完成的。在這里，一口氣被定義為其中一個(gè)身體部位的運(yùn)動(dòng)（取決于魚(yú)的方向）。


斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)的新穎應(yīng)用
為了便于客觀測(cè)量，使用了Noldus的斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)。最初，斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)被設(shè)計(jì)用于自動(dòng)檢測(cè)早期斑馬魚(yú)的活動(dòng)。它可以測(cè)量許多參數(shù)，如：爆發(fā)活動(dòng)/持續(xù)時(shí)間、不活動(dòng)，但也可以測(cè)量更具體的生理參數(shù)，如尾巴卷曲和血液/腸道流量。
由于斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)沒(méi)有內(nèi)置的呼吸檢測(cè)功能，研究人員必須進(jìn)行一些前處理和后處理步驟?？傊?，他們導(dǎo)入的視頻幀速率必須保持不變，因?yàn)榘唏R魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)無(wú)法處理不規(guī)則的幀速。然后，必須在程序中繪制感興趣的區(qū)域，然后為本研究?jī)?yōu)化檢測(cè)設(shè)置。關(guān)于K?mmer等人采取的確切步驟，請(qǐng)參閱他們的文章。


接下來(lái)該如何做？
一般來(lái)說(shuō)，斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)的測(cè)量顯示，與手動(dòng)計(jì)數(shù)相比，壓力魚(yú)的呼吸頻率要高得多。這可能意味著手動(dòng)計(jì)數(shù)可能會(huì)錯(cuò)過(guò)呼吸動(dòng)作的情況，尤其是在lindane濃度較高的情況下，當(dāng)呼吸頻率急劇增加，動(dòng)作變得快速和不規(guī)則時(shí)。此外，在這些情況下，人工計(jì)數(shù)低估了呼吸頻率高達(dá)250%。
有了斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)的這一新應(yīng)用，研究人員能夠成功測(cè)量斑馬魚(yú)幼魚(yú)和胚胎的呼吸頻率和振幅。這些客觀的測(cè)量方法在斑馬魚(yú)研究中，特別是在毒理學(xué)和藥理學(xué)方面非常有價(jià)值。它使研究人員能夠看到某些物質(zhì)和藥物在不同生命階段的影響，而這在以前是不可能的。
K?mmer等人最后表示，雖然使用斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)進(jìn)行這一分析需要一些步驟，但這是一個(gè)值得進(jìn)一步研究和驗(yàn)證的有趣課題。此外，手動(dòng)設(shè)置感興趣區(qū)域也可用于檢測(cè)斑馬魚(yú)的其他小動(dòng)作，如眼球運(yùn)動(dòng)或塑料顆粒通過(guò)腸道或鰓。


參考文獻(xiàn)
1. K?mmer, N.; Reimann, T.; Ovcharova, V.; Braunbeck, T. A Novel Automated Method for the Simultaneous Detection of Breathing Frequency and Amplitude in Zebrafish (Danio Rerio) Embryos and Larvae. Aquat. Toxicol. 2023, 258, 106493.


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